The role of gram-negative bacteria in the pathogenesis of liver injury involves intestinal bacterial translocation and decreased liver clearance, leading to inflammation, tissue injury and eventually, cirrhosis. A similar damaging role has been credited to gram-positive bacteria. Toll-like receptors (TLRs) participate in the recognition of microorganismassociated molecular patterns (MAMPs) and the activation of pro- and anti-inflammatory mediators. This study compares in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of healthy subjects (controls) and cirrhotic patients, the ability to activate inflammatory pathways of both gram-negative and gram-positive bacteria products. PBMC of 12 controls and 12 outpatients with cirrhosis were studied. PBMC were isolated and cultured with LPS or LTA exposure. All measurements where determined before (ex vivo) and after (in vitro) exposure to LPS or LTA. Ex vivo and in vitro CD14, TLR2 and TLR4 extracellular and intracellular expression were determined by flow cytometry and IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12 and TNF- secretion in supernatants by ELISA. As well as, RNAm expression from CD14, TLR2, TLR4, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12 and TNF- were determined by real time PCR. Data are summarized as median values and analyzed by Wilcoxon tests. Cirrhotic PBMC presented a hyperactivated status primarily traduced in higher plasmatic cytokine levels, specifically IL-6, IL-10 and IL-12. Bacterial products exposure, specifically LPS, induced a decreased of CD14 intracellular expression, as well as, an increased of TLR2 intracellular expression versus NE. Extracellular TLR4 expression trends to decreased with LTA stimulus. LPS was capable to induce an extracellular TLR2 differential expression between groups. Cytokine secretion increased after LPS or LTA exposure, being more vigorous with LPS, in both groups. LTA was capable to induce a differential production between groups. TLR2, TNF-α, IL-12 e IL-1β RNAm expression suggested that TLR2 and TNF-α RNAm expression were induce by LPS and IL-12 RNAm expression by LTA. However, IL1β RNAm expression seems to be induced by both stimuli. LTA induced a significantly decreased in TNF-α RNAm expression. In conclusion, Cirrhotic patients PBMC present a hyperactivated status. PBMC exposure to bacterial products is capable to activate inflammatory cytokine production with transcriptional regulation. A higher size sample, as well as molecular studies, will explain recognition mechanisms and bacterial products internalization in PBMC of cirrhotic patients.
El papel de las bacterias gram-negativas en la patogénesis del daño hepático involucra la translocación bacteriana intestinal y la disminución de la depuración hepática, promoviendo la inflamación, daño de tejido y eventualmente, cirrosis. Un papel dañino similar se le ha adjudicado a bacterias gram-positivas. Los receptores tipo-Toll (TLRs) participan en el reconocimiento de patrones moleculares asociados a microorganismos (MAMPs) y la activación de mediadores pro- y anti-inflamatorios. Este estudio compara, en células mononucleares periféricas (PBMC) de sujetos sanos (controles) y pacientes cirróticos, la habilidad de activar vías de reconocimiento de ligandos y respuesta inflamatoria, tanto de bacterias gram-negativas, como gram-positivas. PBMC de 12 controles y 12 pacientes externos con cirrosis se estudiaron. PBMC se aislaron y cultivaron con la exposición a LPS o LTA. Todas las determinaciones fueron realizadas antes (ex vivo) y después (in vitro) de la exposición a LPS o LTA. La expresión extracelular e intracelular de CD14, TLR2 y TLR4 ex vivo e in vitro se determinó por citometría de flujo y la secreción de IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12 y TNF- en los sobrenadante por ELISA. Así como la expresión de RNAm de CD14, TLR2, TLR4, IL-1β, IL-6, IL-10, IL12 y TNF- determinada por PCR en tiempo real. Los datos se presentan como medianas y se analizaron con la prueba de Wilcoxon. PBMC de pacientes cirróticos presentan un estado de hiperactivación traducido principalmente en concentraciones plasmáticas mayores de citocinas inflamatorias, IL-6, IL-10 e IL-12. La exposición a ligandos bacterianos, específicamente LPS, a las PBMC de pacientes cirróticos induce una disminución de la expresión intracelular de CD14 así como un aumento de la expresión
5203 |a intracelular del TLR2 con respecto a los NE. El TLR4 tiende a disminuir su expresión extracelular cuando se estimulan las células con LTA. El LPS es capaz de inducir una diferencia de expresión intracelular del TLR2 entre grupos. La secreción de citocinas aumentó después de la exposición por LPS o LTA, siendo más vigorosa con LPS, en ambos grupos. El LTA es capaz de inducir una producción significativa diferencial entre cirróticos y controles. La expresión del RNAm de TLR2, TNF-α, IL-12 e IL-1β, sugiere que el transcrito de TLR2 y TNF-α son inducidos por LPS y el de IL-12 por LTA. Sin embargo, el transcrito de IL-1β parece ser inducido por ambos estímulos. Sólo el LTA indujo una disminución significativa del transcrito de TNF-α En conclusión, PBMC de pacientes cirróticos presentan un estado de hiperactivación. La exposición de PBMC de pacientes cirróticos a ligandos bacterianos es capaz de activar la producción de citocinas inflamatorias, así como su regulación a nivel transcripcional. El aumento del tamaño de muestra, así como otros estudios ayudarán a explicar y dilucidar los mecanismos de reconocimiento e internalización de ligandos bacterianos en PBMC de pacientes cirróticos.
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