Participación de las MAPK en la regulación del factor de transcripción AP1 y en la producción de Hsp70 en células HepG2 tratadas con cadmio Pubblico Deposited
La población en general está expuesta a contaminantes como el cadmio (Cd). Se ha sugerido que el Cd puede producir especies reactivas de oxígeno (ERO) que tienen un papel como mediadores intracelulares. El factor de transcripción AP1 es sensible a ERO y es activado por el Cd. Sin embargo, no se conoce con exactitud la vía de transducción de señales responsable de esta la activación. Se conoce que AP1 es fosforilado por las MAKP (ERK, p38 y JNK) y que activa genes de sobrevivencia, además esta constituido por homodímeros Jun/Jun o heterodímeros Jun/Fos. Es por ello que el objetivo de este proyecto fue estudiar la vía de señalización MAPK/AP1 en respuesta al Cd en células HepG2 y su participación en la inducción de la proteína de choque térmico 70 (Hsp70). Las células HepG2 fueron tratadas con 5 μM de CdCl2 por diferentes tiempos de incubación (0, 1, 2, 3, 4, 5 y 6 h) y se determinó la activación del factor AP1 por EMSA y la activación de ERK, p38 y JNK por Western blot. Para poder evaluar la composición de AP1 se realizó un super retardo y EMSA utilizando anticuerpos para c-Jun y c-Fos en las células tratadas con 5 μM de CdCl2. Para evaluar la participación de las MAPK en la activación de AP1 y en la producción de Hsp70, las células fueron pre-tratadas con los inhibidores para ERK (PD98059), p38 (SB203580) y JNK (SP600125), seguidas de 5 μM de CdCl 2. Para determinar la procedencia de las ERO en la activación de las MAPK (ERK, p38 y JNK), las células fueron pre-tratadas con KCN para inhibir la función mitocondrial, alopurinol para inhibir a la xantina oxidasa, seguidas de 5 μM de CdCl2. Por otro lado, las células HepG2 fueron pre-tratadas con butinona-L-sulfoximina (BSO), para depletar el glutatión (GSH). Los resultados mostraron que la activación de AP1 y la fosforilación de las ERK, p38 y JNK fueron dependientes del tiempo de exposición al CdCl 2. La composición de AP1 fue c- Jun/c-Jun. Además, encontramos que los inhibidores de las MAPK disminuyeron significativamente la activación de AP1 y la producción de la Hsp70 en las células tratadas con CdCl 2. Por otro lado, observamos que la activación de las MAPK (ERK, p38 y JNK) disminuyó significativamente con los inhibidores. Con estos resultados podemos concluir que el Cd puede activar al factor AP1 y a las MAPK. Además, el AP1 esta constituido por las subunidades c-Jun/c-Jun y es regulado por las MAPK. Por otro lado, las ERO tienen un papel importante como segundos mensajero en la activación de las MAPK. ERK1/2 y JNK participan en la producción Hsp70 en células HepG2 tratadas con Cd y puede ser mediada por el AP1 por contener en su región promotora secuencias específicas para el reconocimiento de este factor.
Cadmium (Cd) is an environmental pollutant, and general population is exposure continuously to it. It has been suggested that Cd may produce reactive oxygen species (ROS), and they could play an important role in intracellular signaling for cellular response. The activator protein 1 (AP1) is a transcription factor that is sensitive to ROS. Actually, Cd- signal transduction pathway responsible for AP1 activation has not been described. It is known that AP1 can be phosphorylated by mitogen activated protein kinases (MAPK) ERK, p38 and JNK that could activate survival genes. The AP1 quaternary structure could be constituted by Jun/Jun homodimers or Jun/Fos heterodimers. The aim was to provide a greater insight into the effect of Cd on mitogen-activated protein kinases (MAPK) involved in signal transduction, its relationship with AP1 activation, and heat shock protein (Hsp)70 production. HepG2 cells were incubated in the presence of CdCl2 (5 μM) at different periods from 1 to 6 hours. AP1 activation was determined by an electrophoretic mobility shift assay (EMSA); and ERK, p38 and JNK activation by Western Blot. In order to evaluate AP1 dimer composition a supershift EMSA was performed, exposing the CdCl 2 treated cells to c-Jun and c-Fos specific antibodies. To evaluate MAPK participation in AP1 activation and Hsp70 induction, cells were pretreated with ERK, p38 and JNK inhibitors (PD98059, SB203580 and SP600125 respectively) followed by CdCl 2 exposure. In order to elucidate the origin of ROS involved in the MAPK (ERK, p38 and JNK) activation, cells were pre-treated with KCN to inhibit mitochondrial function and allopurinol to inhibit xanthine oxidase, followed by Cd treatment. On the other hand, HepG2 cells received a pre-treatment with buthionine-L- sulfoximine (BSO) to deplete glutathione (GSH). Results showed that Cd-induced AP1 activation depended on ERK, p38, JNK phosphorylation. AP1 composition was c-Jun/c-Jun. Also data showed that Cd-induced AP1 activation and Hsp70 production decreased significantly in presence of MAPK inhibitors. Moreover, we observed that MAPK (ERK, p38 and JNK) activation was reduced in presence of mitochondrial function and xanthine oxidase inhibitors and GSH depletor. With these results, we can conclude that cadmium could activate MAPK signaling pathway by an indirect ROS generation. MAPK are responsible for AP1 activation. Only ERK1/2 and JNK participated in Hsp70 production, conferring cell protection against cadmium damage. It is important to investigate the molecular events involved in high viability cadmium concentration exposure prior to the Cd- induced cellular toxicity and damage in HepG2 cells because the initial cadmium accumulation and toxicity is the liver.
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