Papel de las Especies Reactivas de Oxígeno en la biosíntesis de Penicilina G, Cefalosporina C y Lovastatina Público Deposited
In previous work on the production of lovastatin by Aspergillus terreus, we found that the concentration of reactive oxygen species (ROS) increased to high levels precisely at the beginning of the production phase (idiophase) and that these levels were maintained throughout the idiophase. Furthermore, ROS were shown to regulate lovastatin biosynthesis. Regulation by ROS has also been reported for aflatoxins. It has been suggested that, due to their antioxidant activity, aflatoxins are regulated and synthesized as a second line of defence against oxidative stress. To study the possible regulation of ROS of other secondary metabolites of industrial importance, we analysed the relationship between ROS and penicillin G biosynthesis by Penicillium chrysogenum and cephalosporin C biosynthesis by Acremonium chrysogenum. The results revealed a similar accumulation of ROS in the idiophase in the penicillin and cephalosporin fermentations. Furthermore, when the intracellular concentrations of ROS were decreased by adding antioxidants to the cultures, the production of penicillin and cephalosporin was drastically reduced. When intracellular ROS were increased by adding exogenous ROS (H2O2) to the cultures, proportional increases in penicillin and cephalosporin biosynthesis were obtained. Finally, we demonstrate that this increase and decrease in the production induced by the manipulation of ROS was due to the biosynthetic gene pcbcAB being over-expressed or repressed, in A. chrysogenum and P. chrysogenum. Thus, demonstrating that ROS regulate penicillin and cephalosporin biosynthesis at the transcriptional level. Furthermore, we analysed whether the levels of natural ROS determined the production capacity of secondary metabolites in different strains of the same species; and we found that the profile and levels of ROS are the same between high and low production strains, but the natural levels of ROS do vary between species. On the other hand, in the lovastatin model, it was also evaluated whether the transcription factors of oxidative-stress response SrrA and MsnA played a role in the regulation of lovastatin biosynthesis, induced by the accumulation of ROS; this was evaluated through silencing of these genes in A. terreus. The SisrrA mutants were found to have an effect only in submerged fermentation (SmF), where they produced more lovastatin, and there was a greater accumulation of ROS in idiophase. While the SimsnA, showed overproduction in SmF and SSF (Solid-State Fermentation), being in the latter where the increase was very large; however, the attenuation of msnA did not affect ROS levels. Our results provide evidence that regulation by ROS is a general mechanism that controls secondary metabolism in fungi. And, in the lovastatin model, SrrA and MsnA are part of the regulatory circuit, acting as negative regulators, and in the case of SrrA, their regulation is specific to SmF.
En un trabajo anterior sobre la producción de lovastatina por Aspergillus terreus, encontramos que la concentración de especies reactivas de oxígeno (EROs) aumentó a niveles altos precisamente al inicio de la fase de producción (idiofase) y además estos niveles se mantuvieron durante toda la idiofase. Además, se demostró que las EROs regulan la biosíntesis de lovastatina a nivel transcripcional. La regulación por EROs también se ha reportado para aflatoxinas. Se ha sugerido que, debido a su actividad antioxidante, las aflatoxinas se regulan y sintetizan como una segunda línea de defensa contra el estrés oxidante. Para estudiar la posible regulación de EROs de otros metabolitos secundarios de importancia industrial, analizamos la relación entre EROs y la biosíntesis de penicilina G por Penicillium chrysogenum y la biosíntesis de cefalosporina C por Acremonium chrysogenum. Inicialmente se demostró que ni la lovastatina ni la penicilina ni la cefalosporina C muestran una actividad antioxidante. Los resultados revelaron una acumulación similar de EROs en la idiofase en las fermentaciones de penicilina y cefalosporina. Además, cuando las concentraciones intracelulares de EROs disminuyeron mediante la adición de antioxidantes a los cultivos, la producción de penicilina y cefalosporina se redujo drásticamente. Cuando se aumentaron las EROs intracelulares mediante la adición de EROs exógenas (H2O2) a los cultivos, se obtuvieron incrementos proporcionales en las biosíntesis de penicilina y cefalosporina. Finalmente, demostramos que este aumento y disminución en la producción inducida por la manipulación de EROs se debía a que el gen biosintético pcbcAB se sobre expresaba o reprimía, en A. chrysogenum y P. chrysogenum. Demostrando así, que las EROs también regulan la biosíntesis de penicilina y cefalosporina a nivel transcripcional. Además, analizamos si los niveles de EROs naturales determinaban la capacidad de producción de metabolitos secundarios en diferentes cepas de una misma especie; y encontramos que el perfil y los niveles de EROs son los mismos entre cepas de alta y baja producción, pero los niveles naturales de EROs sí varían entre especies. Por otro lado, en el modelo de lovastatina, también se evaluó si los factores de transcripción de respuesta a estrés oxidante SrrA y MsnA, jugaban un papel en la regulación de la biosíntesis de lovastatina, inducida por la acumulación de EROs; esto se evaluó a través de silenciamientos de estos genes en A. terreus. Se encontró que las mutantes silenciadas en el gen srrA (SisrrA) sólo mostraron un efecto en fermentación en medio líquido (FL), donde produjeron más lovastatina, y hubo una mayor acumulación de EROs en idiofase. Mientras que las SimsnA, mostraron sobreproducción en FL y fermentación sólida (FS), siendo en ésta última donde el aumento fue muy grande. Es interesante destacar que la atenuación de msnA no afectó los niveles de EROs. Nuestros resultados proporcionan evidencia de que la regulación por EROs es un mecanismo general que controla el metabolismo secundario en hongos. En el modelo de lovastatina, SrrA y MsnA forman parte del circuito de regulación, fungiendo como reguladores negativos, y en el caso de SrrA, su regulación es específica de la FL.
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