Efecto de la sobreexpresión de BCL-2 sobre la proliferación y senescencia de las células estelares hepáticas in vitro Public Deposited
La fibrosis hepática es una enfermedad multifactorial causada por varios agentes tóxicos, se sabe que el estrés oxidativo es uno de los principales agentes que promueve la activación de las células estelares. Estas células aumentan la producción de las proteínas que constituyen la matriz extracelular, como es el caso de colágena tipo I y III, dañando al hígado. Por otro lado, la proteína Bcl-2 es una molécula de 26 KDa, que está relacionada con la supervivencia celular y la protección contra el estrés oxidativo. Así mismo se ha observado que en algunos tipos celulares al sobreexpresar a dicha proteína, se induce un proceso llamado senescencia replicativa. Durante la senescencia las células detienen su ciclo en la fase G0/G1, además presentan cambios tales como, la resistencia a estímulos apoptóticos, incremento en la cantidad de vacuolas pero permanecen metabólicamente activas. De modo que el objetivo de este trabajo fue sobreexpresar a la proteína Bcl-2 en una línea de células estelares hepáticas con el fin de inducir la senescencia replicativa y así disminuir la proliferación celular, y por lo tanto la fibrosis. Se utilizó la línea celular este lar hepática CFSC-2G, a la cual se le indujo la sobreexpresión de la proteína Bcl-2 mediante la técnica de lipofección. Se obtuvieron tres clonas que sobre-expresaron 2, 5 y 9 veces a la proteína Bcl-2 en relación con los controles. Esto se corroboró mediante un inmunoanálisis tipo Western blot. Al mismo tiempo se obtuvo una línea que únicamente sobreexpresa a la proteína verde reportera, como control de transfección (GFP+). Para evaluar los efectos de la sobreexpresión de Bcl-2 se utilizó la clona que sobreexpresa a la proteína en 9 Veces (Bcl-2+). No se encontraron diferencias significativas encuanto a los resultados de la proliferación y la síntesis de ADN, como tampoco en el estudio en la actividad de la enzima b-galactosidasa, que es un marcador de células senescentes. Sin embargo se encontró un efecto de protección contra el estrés oxidativo cuando las células fueron tratadas con 300 mM H2O2 por una hora. Obteniéndose una protección del 35.7 % en las células Bcl-2+ en comparación con las GFP+ y CFSC-2G. Como conclusión puede decirse que en este modelo la sobreexpresión de Bcl-2 no induce senescencia replicativa pero si protege a las células estelares del estrés oxidativo.
Liver fibrosis is a multifactorial disease caused by different toxic agents. It is known that oxidative stress is one of the main agents that promotes hepatic stellate cells activation. These cells increase the extracellular matrix proteins production, such as collagen type I and III, damaging the liver. Bcl-2 is a 26 kDa protein that has been associated with cellular survival and protection against oxidative stress. Is has been observed in several cell types Bcl-2 overexpression induces replicative senescence. During senescence, cells arrest their cell cycle in G0/G1 phase, they become resistant to apoptotic stimulus, they increase their vacuolar content, but they preserve an active metabolism. The aim of this work was to overexpress Bcl-2 protein in a hepatic stellate cell line to induce replicative senescence and by this way diminish cellular proliferation and hepatic fibrosis. The hepatic stellate cell line CFSC-2G was used, and Bcl-2 overexpression was done by the Lipofectin reagent. Three different clones were obtained that overexpressed Bcl-2 in 2, 5 and 9 times. The overexpression was corroborated by western blot analysis. At the same time another cell line, that overexpressed only the reporter green protein was obtained as a transfection control (GFP+). The clone that overexpressed Bcl-2 nine times was used to evaluate the effects of Bcl-2 overexpresssion (Bcl-2+). No significative differences were found in relation to proliferation and DNA synthesis, neither were found in the SA-beta-galactosidase assay, which is used as a senescent marker. However, a protection effect against oxidative stress was found when the cells were treated with 300 mM H2O2. Bcl-2+ cells were found to survive 35.7% more that control cells (GFP+ and CFSC-2G). The conclusion of this work is that in this particular model, Bcl-2 overexpression did not induced senescence but it protects against oxidative stress.
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