Análisis comparativo del proteoma de Aspergillus brasiliensis en cultivos sólido y líquido Público Deposited
The present work was focused on the characterization of Aspergillus brasiliensis proteome, assessing the culture system and sucrose concentration present in the culture medium. The work was parted into two stages. In the first stage, the effect of sucrose concentration under SSF (20 to 210 g/L, using perlite as support) and SmF (20 to 80 g/L) over (i) extracellular inulinase and invertase production and (ii) associated variables with A. brasiliensis growth, estimated from online CO2 production measurement was evaluated. The analysis revealed a lower Lag phase in SSF compared to SmF and, decrease in the specific CO2 production rate (μCO2) in both systems as the sucrose concentration increased. The highest maximum CO2 production rate (10.45 ± 0.72 mg/h mL) and total CO2 production (138.53 ± 6.48 mg/mL) were obtained in SSF with a sucrose concentration of 210 g/L. Inulinase and invertase production in SmF was independent of the initial sucrose concentration (1.13 ± 0.02 and 5.84 ± 0.12 U/mL, respectively); meanwhile in SSF, both activities increased with the increase in the sucrose concentration, reaching maximum values of 5.88 ± 0.78 and 41.69 ± 3.60 U/mL (inulinase and invertase, respectively), at the highest sucrose concentration (210 g/L). The zymographic analysis developed with enzymatic extracts obtained with 60 g/L of sucrose under SSF and SmF showed one band of inulinase and two bands of invertases involved in sucrose hydrolysis. In the second stage, the A. brasiliensis proteomes were obtained under SSF (sucrose: 20 to 180 g/L) and SmF (sucrose: 20 to 60 g/L) conditions. The proteome was more complex in SSF than in SmF. A total of 1471 and 953 proteins were identified, respectively. In SSF, 237 proteins (88 unique, 75 abundant unregulated, and 74 abundant regulated) were studied at sucrose concentrations < 60 g/L and 343 proteins (195 unique, 98 abundant unregulated, and 50 abundant regulated) were analyzed at sucrose concentrations > 180 g/L. In SmF, 277 proteins (128 unique, 73 abundant unregulated, and 76 abundant regulated) were examined. The proteome in SSF was 3.3 (from 20 to 60 g/L) and 4.8 (from 60 to 180 g/L) times more abundant than in SmF. In SSF there was the presence of proteins involved in a greater number of processes than in SmF. The weighted spectral count of uncharacterized, transport-associated proteins, of nucleotide and amino acid metabolism was so low that it can be considered negligible in SmF. The associated carbohydrate metabolism proteins were the most abundant group in SSF (49.98 and 80.42 spectral count/mL at sucrose concentrations of 20 to 60 g/L and 60 to 180 g/L, respectively). The sum of the weighted spectral count of all the proteins involved in this metabolism was almost 12 and 19 times more abundant than in SmF, where it ranked sixth in terms of abundance. Proteins classified as miscellaneous were the second most abundant group in SSF (40.89 and 59.66 spectral count/mL with concentrations of 20 to 60 g/L and 60 to 180 g/L, respectively). This group of proteins in SmF ranked third in terms of abundance. In the proteome in SSF and SmF, proteins involved in hydrocarbon degradation, antibiotic biosynthesis, and pathogenicity were found, with a greater variety of these in CMS. In the proteome in SSF with 20 to 60 g/L of sucrose, the third most abundant group of proteins was classified as cellular component/process (40.44 spectral count/mL), while with 60 to 180 g/L of sucrose, it ranked fourth (41.85 spectral count/mL). This group of proteins in SmF was the most abundant (27.77 spectral count/mL), giving evidence that cellular processes associated with DNA replication and transcription, and cell wall synthesis predominate in this culture system.Therefore, the findings obtained in the present work show new evidence to propose that catabolism predominates over anabolism in SSF.
El presente proyecto se centró en la caracterización del proteoma de Aspergillus brasiliensis, evaluando el efecto del sistema de cultivo y la concentración de sacarosa presente en el medio. El trabajo fue dividido en dos etapas. En la primera etapa se evaluó el efecto de la concentración de sacarosa en CMS (20 a 210 g/L, utilizando agrolita como soporte) y en CML (20 a 80 g/L) sobre (i) la actividad inulinasa e invertasa y (ii) variables asociadas con el crecimiento de A. brasiliensis, estimadas mediante la medición en línea de la producción de CO2. El análisis de las variables obtenidas reveló menor tiempo de fase Lag en CMS comparado con CML y disminución de la tasa específica de producción de CO2 (µCO2) en ambos sistemas de cultivo al aumentar la concentración de sacarosa. El valor máximo de la tasa máxima de producción de CO2 (10.45 ± 0.72 mg/h mL) y producción total de CO2 (138.53 ± 6.48 mg/mL) se obtuvo en CMS con 210 g/L de sacarosa. La producción de inulinasa e invertasa en CML fue independiente de la concentración inicial de sacarosa (1.13 ± 0.02 y 5.84 ± 0.12 U/mL, respectivamente); mientras que en CMS ambas actividades enzimáticas incrementaron con el aumento en la concentración de sacarosa, alcanzando valores máximos de 5.88 ± 0.78 y 41.69 ± 3.60 U/mL (inulinasa e invertasa, respectivamente), con la concentración más alta de sacarosa (210 g/L). Zimogramas de actividad inulinasa e invertasa desarrollados con extractos enzimáticos obtenidos con 60 g/L de sacarosa en CMS y CML revelaron una banda de inulinasa y dos de invertasa involucradas en la hidrólisis de sacarosa. En la segunda etapa, se obtuvieron los proteomas de A. brasiliensis en CMS (sacarosa: 20 a 180 g/L) y CML (sacarosa: 20 a 60 g/L). El proteoma fue más complejo en CMS que en CML. Se identificaron 1471 y 953 proteínas, respectivamente. En CMS, 237 proteínas (88 únicas, 75 abundantes no reguladas y 74 abundantes reguladas) fueron analizadas con concentraciones de sacarosa < 60 g/L y 343 proteínas (195 únicas, 98 abundantes no reguladas y 50 abundantes reguladas) fueron analizadas con concentraciones de sacarosa > 60 g/L. En CML, 277 proteínas (128 únicas, 73 abundantes no reguladas y 76 abundantes reguladas) fueron analizadas. El proteoma en CMS fue 3.3 (de 20 a 60 g/L) y 4.8 (de 60 a 180 g/L) veces más abundante que en CML. En CMS hubo presencia de proteínas involucradas en mayor número de procesos que en CML. La cuenta espectral ponderada de las proteínas asociadas con el transporte, sin caracterizar, del metabolismo de nucleótidos y aminoácidos fue tan baja que se puede considerar despreciable en CML. Las proteínas asociadas con el metabolismo de carbohidratos fueron el grupo más abundante en CMS (49.98 y 80.42 cuentas espectrales/mL con concentración de sacarosa de 20 a 60 g/L y de 60 a 180 g/L, respectivamente). La suma de la cuenta espectral ponderada de todas las proteínas involucradas en este metabolismo fue casi 12 y 19 veces más abundante que en CML, donde ocupó el sexto lugar en términos de abundancia. El grupo de proteínas clasificadas como misceláneas fue el segundo grupo más abundante en CMS (40.89 y 59.66 cuentas espectrales/mL con concentraciones de 20 a 60 g/L y de 60 a 180 g/L, respectivamente). Este grupo de proteínas en CML ocupó el tercer lugar en términos de abundancia. En el proteoma en CMS y CML se encontraron proteínas involucradas en la degradación de hidrocarburos, biosíntesis de antibióticos y patogenicidad, habiendo mayor variedad de éstas en CMS. En el proteoma en CMS con 20 a 60 g/L de sacarosa, el tercer grupo de proteínas más abundante fue el clasificado como componente/proceso celular (40.44 cuentas espectrales/mL) mientras que con 60 a 180 g/L de sacarosa ocupó el cuarto lugar (41.85 cuentas espectrales/mL). Este grupo de proteínas en CML fue el más abundante (27.77 cuentas espectrales/mL) dando evidencia de que en este sistema de cultivo predominan procesos celulares asociados con la replicación y transcripción de ADN, y la síntesis de pared celular. Por lo tanto, los hallazgos obtenidos en el presente trabajo muestran nuevas evidencias para proponer que en CMS el catabolismo predomina sobre el anabolismo.
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