Expresión de la acetilcolinesterasa en linfocitos T humanos normales y en células leucémicas Public Deposited
La acetilcolinesterasa (AChE) hidroliza al neurotransmisor acetilcolina tras su liberación en las sinapsis colinérgicas. El papel biológico de la AChE no está limitado a la transmisión colinérgica, en tejidos no neuronales se ha detectado actividad acetilcolinesterásica. La AChE se presenta en formas globulares como monómeras, dímeras y tetrámeras unidas o no a otros elementos estructurales y en formas asimétricas como tetrámeras, octameras y dodecameras unidos a un tallo colágenico. Las formas moleculares se generan a partir de un gen de 7 Kb, localizado en el cromosoma 7 de humano en la región q22, el cual da origen a tres transcritos. El RNAm con los exones E2-E3-E4-E6 genera subunidades T. El RNAm con E2-E3-E4-E5 genera las subunidades H. En mamíferos se han identificado transcritos R conformados por E2- E3-E4-I4-E5. Es importante conocer cómo se regula la expresión del gen AChE y las formas moleculares que codifica en estados patológicos de proliferación celular (leucemias). Para ello se realizó el análisis de la expresión génica de la acetilcolinesterasa en linfocitos T humanos normales y en células T leucémicas. METODOLOGÍA Se obtuvo sangre periférica de personas sanas, de la cual los leucocitos se aislaron por gradiente de densidad. Los linfocitos T se purificaron con un anticuerpo dirigido contra CD3 adsorbido a perlas magnéticas. El nivel de pureza de linfocitos T se determinó por citometría de flujo usando anti-CD3-PerCP. Para el análisis de AChE en células leucémicas T se utilizó la línea celular T Jurkat E6-1. Para analizar la expresión de la AChE humana se diseñaron primers específicos para los transcritos AChE-H, AChE-T y AChE-R y se determinó su nivel de expresión en ambos tipos celulares por RT-PCR. La AChE de linfocitos T y células Jurkat se extrajo sin y con Triton X-100. La actividad de AChE se midió por el método de Ellman y el contenido de proteínas por el procedimiento propuesto por Bradford. La glicosilación de AChE se estableció usando lectinas de diferente especificidad. Las formas moleculares de la AChE se determinaron por el análisis de sedimentación en gradientes de sacarosa. RESULTADOS Y CONCLUSIONES El análisis de citometría de flujo de los linfocitos T mostró un nivel de pureza del 97%. La expresión del gen AChE mostró que los transcritos en linfocitos T normales correspondieron al tipo AChE-H. En tanto que, en las células leucémicas se detectaron transcritos AChE-H y AChE-T. En linfocitos T normales la actividad específica AChE fue semejante en fracciones S1 y S2. Mientras que, en células leucémicas la fracción S2 presenta menor actividad que S1, lo que indica que existe mayor AChE no ligada o débilmente ligada a la membrana en células leucémicas. La AChE presente en los linfocitos T mostró incorporación de glucosa (33%), manosa (66%), ácido siálico o galactosa (75%) y N-acetil-glucosamina (63%), este hecho resalta su maduración post-traduccional. En el caso de la enzima en células leucémicas, alrededor de un 66% presentó glucosa, un 72% incorporó manosa, un 67% presentó galactosa o ácido siálico y un 67% con N-acetil-glucosamina, señalando una alteración en la maduración post-traduccional en las células leucémicas. El análisis de formas moleculares confirmó que los transcritos AChE-H se encargaron de la síntesis de dímeros (5.2S) y monómeros (3.5S) anclados a la membrana plasmática por un enlace glicofosfatidilinositol). En las células leucémicas los transcritos AChE-T producen tetrámeros hidrofílicos (10.6S), lo cual demostró una alteración de la expresión del gen AChE en tales células.
Acetylcholinesterase (AChE) hydrolyzes acetylcholine (ACh) after its release in the cholinergic synapses. Their biological role is not limited to cholinergic transmission, since it has been also detected in non-neuronal tissues. AChE shows globular forms like monomers, dimmers and tetramers with or without structural elements, and asymmetrical forms like tetramers, octamers and dodecamers bound with a collagenic tail. All these molecular forms are generated from a 7 Kb gene located in the q22 region of chromosome 7 in humans that are processed into one of three different transcripts. RNAm´s containing exons E2-E3-E4-E6 generates T subunits where’s those made of E2-E3-E4-E5, generate H subunits. In mammals has been identified R transcripts formed by E2-E3-E4-I4-E5. It is important to know how it regulates gene expression AChE and molecular forms which are codified in pathological states of cell proliferation (leukemia). We made an analysis of the expression of the acetylcholinesterase gene in normal human T lymphocytes and leukemic T-cells. METHODOLOGY Peripheral blood was collected from healthy people; leukocytes were isolated by density gradients. The T lymphocytes were purified with anti-CD3 adsorbed to magnetic beads. The purified cells were determined by flow cytometry using anti-CD3-PerCP. The cell line T Jurkat E6-1 was used for the analysis of AChE in leukemic T cells. Specific primers were designed for each transcript of AChE human (AChE-H, AChE-T and AChE-R) and the transcripts expression was determined in both cell types by RT-PCR. The AChE of lymphocytes T and Jurkat cells were solubilised without and with Triton X-100. The activity of AChE was measured by the Ellman method and the protein content was measured by the Bradford procedure. The AChE glycosylation was established using lectins with different specificity. The molecular forms of AChE were determined by the sedimentation analysis in sucrose gradients. RESULTS AND CONCLUSIONS The analysis of flow cytometry has founded a purity of 97% in T lymphocytes. In normal T lymphocytes the specific activity of the fractions S1 and S2 was very similar. While in leukemic cells the fraction S2 presents less activity that S1, this indicated that exist more AChE unbound or weakly bound to the membrane in leukemic cells. The transcripts identified in normal T lymphocytes were AChE-H, while in leukemic cells the transcripts detected were AChE-H and AChE-T. The AChE present in T lymphocytes showed incorporation of glucose (33%), manose (66%), scialic acid or galactose (75%) and Nacetylglucosamine (63%), this fact underlines its post-traduccional maturation. In the case of AChE in leukemic cells, around a 66% present glucose, a 72% present manose, a 67% present galactose or scialic acid and 67% present N- acetylglucosamine, indicating an alteration in the post-traductional maturation of the enzyme in leukemic cells. Molecular forms identified in normal T lymphocytes were amphiphilic dimers (5.2S) and monomers (3.5S) anchored to the plasma membrane by a glycosilphosphatidilinositol structure, while in leukemic giving rise to hydrophilic tetramers (10.6S) of AChE, this shows an alteration of AChE gene expression in this cells.
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