Separación e identificación de péptidos bioactivos liberados por bacterias lácticas Public Deposited
In this thesis peptides with biological activity have been separated and identified, mainly peptides with antihypertensive activity in commercial fermented milk with Streptococcus thermophilus and Lactobacillus acidophilus, during refrigerated storage. This thesis is structured in three parts. In the first part analysis of soluble peptides determination by Lowry technique was made, this in order to 1) determine the effect of time lapse of commercial fermented milk on the amount of soluble peptides found and 2) to standardize the amount of protein for further analysis. It was determined that no matter the time of preparation of fermented milk, the concentration of peptides followed a pattern of accumulation and formation, there was a growing trend of accumulation until day 10, which reached a maximum and remained constant until the end of the study. With these results, it was possible to standardize the amount of protein for further analysis. In a second part, the formation of peptides by special electrophoresis for peptides and denaturing electrophoresis were performed. In the denaturing electrophoresis the changes in protein concentration of milk, mainly - lactalbumin -lactoglobulin and casein were showed. During the concentration analysis a decline concentration of casein was observed, which went from 5.2 to 1.84 mg / mL, whereas in the serum proteins, showed decreases of 0.4 to 0.2 mg / mL in - lactalbumin and 1.6 to 0.4 mg / mL in -lactoglobulin. These results showed that peptides were formed principally of caseins, while lactoglobulin is the main whey protein in the formation of peptide fractions after fermentation. On the other hand it was determined that there was a steady accumulation and formation of peptides until day 7 where it remained constant and it was increased at the end of refrigerated storage. These results support the results of the analysis of soluble peptides in the first part of the study. In the third part of this thesis was the analysis of peptide fractions, using molecular exclusion HPLC. In this analyzed the concentration and molecular weight of the separated peptides were analyzed. It was found that the pattern of behavior was similar to that of electrophoresis, peptide accumulation until day 7, remaining constant until day 11 and an increase towards the end of the evaluation was observed. Separation was achieved between 10 and 12 peptides, which were located molecular weight peptides of less than 2 kDa (1.4 and 0.87), corresponding to a molecular weight of bioactive peptides reported. On the other hand detections of aromatic amino acids in the peptide fractions separated were made, since these amino acids are associated with peptides with antihypertensive and 4 peptides with a positive response to this study were found, of which three matches were found in molecular weight with some reported as antihypertensive peptides
En la presente Tesis Doctoral se ha llevado a cabo la separación e identificación de péptidos con actividad biológica, principalmente péptidos con actividad antihipertensiva, en una leche fermentada comercial, con Streptococcus thermophilus y Lactobacillus acidophilus, durante el almacenamiento refrigerado. Esta tesis se ha estructurado en tres partes. En la primera parte se realizaron los análisis correspondientes a la determinación de péptidos solubles por la técnica de Lowry con la finalidad de: 1) determinar el efecto del tiempo de caducidad de la leche fermentada comercial, sobre la cantidad de péptidos solubles encontrados y 2) para estandarizar la cantidad de proteína para los análisis posteriores. Se pudo determinar que sin importar la fecha de elaboración de la leche fermentada, la concentración de péptidos, seguía un patrón de formación y acumulación, se observó una tendencia creciente de acumulación hasta el día 10, donde se alcanzó un máximo y se mantuvo constante hasta el final del estudio. Con los resultados obtenidos, se logró estandarizar la cantidad de proteína para los análisis posteriores. En una segunda parte, se realizó un estudio de formación de péptidos por medio de electroforesis para péptidos, y una electroforesis desnaturalizante SDSPAGE. Esta última con la finalidad de determinar los cambios de concentración de proteínas de la leche durante el almacenamiento, principalmente, lactoalbúmina, lactoglobulina y caseínas. Durante el análisis de concentración en el gel de electroforesis, se observó una disminución constante en la concentración de caseínas que pasó de 5.2 a 1.8 mg/mL, mientras que en las proteínas del suero, se presentaron disminuciones de 0.4 a 0.2 mg/mL en - lactoalbúmina y de 1.6 a 0.4 mg/mL en -lactoglobulina. Estos resultados mostraron que la formación de péptidos es originada a partir de caseínas, mientras que la -lactoglobulina es la proteína del suero que se degrada en mayor proporción. Por otro lado se determinó que hubo una formación y acumulación constante de péptidos hasta el día 7, posteriormente presento un aumento al final del almacenamiento refrigerado. Estos resultados soportan los resultados obtenidos en el análisis de péptidos solubles en la primera etapa del estudio En la tercera parte de esta tesis doctoral se realizó el análisis de las fracciones peptídicas, por medio de HPLC por exclusión molecular. Por medio de la aplicación de esta técnica se analizó la concentración y el peso molecular de los péptidos separados. Se encontró que el patrón de comportamiento fue similar al de electroforesis, formación y acumulación de péptidos hasta el día 7, manteniéndose constante hasta el día 11 y mostró un aumento hacia el final de la evaluación. Se lograron separar entre 10 y 12 fracciones peptídicas, entre las que se localizaron las de peso molecular menor a 2 kDa (1.4 y 0.87), que corresponde a pesos moleculares de péptidos bioactivos reportados. Por otro lado, las determinaciones de estas fracciones peptídicas se realizaron a longitudes de onda donde absorben los aminoácidos aromáticos, información relevante ya que estos aminoácidos están presentes en péptidos con actividad antihipertensiva. Se encontraron cuatro fracciones peptídicas con estas características, de las cuales tres coinciden en peso molecular con el peso molecular de péptidos reportados con actividad antihipertensiva.
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